Plastinación

ACTA DE MADRID 2015

SOBRE INSTALACIONES Y ENTORNO DE UNA SALA DE DISECCIÓN

ANFITEATRUM MATRITENSIE. Grabado de Matías de Irala para el libro Anatomía completa del hombre,1757, del Dr. D. Martín Martínez

LA PLASTINACIÓN

Rafael Latorre, Octavio López Albors. Anatomía Veterinaria. Universidad de Murcia.

Introducción
Estas técnicas surgen por iniciativa del Dr. G.von Hagens, quien en 1977, después de varios años de investigación sobre cómo aplicar polímeros en la conservación de material biológico, decidió emplear el término PLASTINATION para denominar este nuevo método de preservación. Tras las primeras publicaciones a finales de la década de los setenta y principios de los ochenta [1,2], se produjo una rápida expansión de estas técnicas, que dio lugar a la creación de numerosos laboratorios de plastinación, situados fundamentalmente en las Facultades de Medicina y de Veterinaria.
En 1982 se organizó el primer congreso sobre plastinación en San Antonio (Texas, USA), denominado: “Preservation of Biological Materials by Plastination”, y al que asistieron ochenta personas. En 1986, coincidiendo con el tercer congreso, se creó la International Society for Plastination (ISP) nombrando como presidente al Dr. Harmon Bickley, (University of Texas at San Antonio, USA), uno de los pioneros de la plastinación en USA. Desde entonces, los congresos de la ISP se han celebrado bianualmente durante los últimos 32 años. En 2004 se organizó en España (Murcia) y el más reciente, en julio de 2014, la decimoséptima edición en San Petersburgo. En paralelo a estos congresos internacionales la ISP organiza los Interim Meetings cada dos años, orientados principalmente a cursos de entrenamiento.
La ISP cuenta con una página web http://isp.plastination.org en la que se reflejan todas las actividades organizadas, así como cualquier otra información de interés relacionada con la plastinación. Por otro lado, la ISP publica desde 1987 el Journal of Plastination (anteriormente Journal of the International Society for Plastination), accesible de forma libre desde la web http://journal.plastination.org. Este journal publica las actas de los congresos y artículos originales relacionados con las técnicas de plastinación y sus aplicaciones. En este sentido, hay que destacar que la ISP también dispone del Plastination Index http://isp.plastination.org/plastinationindex/index.html que agrupa distintos tipos de publicaciones (artículos, comunicaciones, revisiones, tesis, libros) relacionados con las técnicas de plastinación. Este recurso es de gran utilidad y uso sencillo, ya que permite realizar búsquedas bibliográficas siguiendo diferentes criterios como autor, tema, revista, año, etc.

Protocolos de las técnicas
En general, las técnicas de plastinación consisten en una serie de procesos donde los fluidos propios de los tejidos y parte del tejido adiposo son reemplazados por un polímero, bajo condiciones de vacío y normalmente a bajas temperaturas. En esencia, el protocolo se basa en cuatro fases clásicas que caracterizan el procesado de tejidos en histología: fijación, deshidratación, impregnación y polimerización o curado. Cada fase puede modificarse en mayor o menor grado según la técnica concreta. El resultado que se obtiene son preparaciones biológicas limpias, secas, resistentes, de duración ilimitada en el tiempo, que pueden ser examinadas sin necesidad de guantes o cualquier otro tipo de medida preventiva, y que no precisan de tratamientos ni condiciones especiales de almacenamiento [2,3]. La calidad de estas piezas no solo depende del correcto desarrollo de la técnica de plastinación, sino que además, es imprescindible partir de especímenes dignos de ser conservados. No conviene olvidar que la plastinación es solo un método de preservación de material biológico, de tal manera que, solo si se parte de un órgano o una prosección de alta calidad la plastinación permitirá obtener una pieza plastinada de calidad óptima, aunque siempre algo inferior a la del original, debido a la retracción y al daño tisular que sufre el tejido durante su procesado. En concreto, es necesario nombrar la retracción y la rigidez como las principales limitaciones de la plastinación [4].
Ambos factores negativos son inevitables, aunque dependiendo en gran medida del tipo de tejido se pueden controlar y reducir al mínimo. Por otro lado, el uso de órganos plastinados tiene la ventaja de reducir la exposición diaria de los alumnos y profesores a productos tóxicos, pues carecen de olor y permanecen libres de sustancias tóxicas como formaldehído, fenol, alcoholes, etc.
A pesar de que todas las técnicas de plastinación tienen un fundamento similar, dependiendo del tipo de polímero que se utilice y de tipo de preparación anatómica que se obtenga, se habla de técnicas de silicona, para órganos tridimensionales; técnicas de poliéster, para secciones de encéfalo; y técnicas epoxy, para secciones corporales transparentes.

I.- Las técnicas de silicona
Se emplean principalmente para conservar órganos o regiones anatómicas completas, en definitiva, piezas tridimensionales de diferente tamaño, al igual que secciones anatómicas con un grosor superior a 0.5 cm. Son las técnicas de plastinación más conocidas, en concreto la técnica S10 (Biodur ®) es la más común en los laboratorios de plastinación de Europa y USA. Tiene como principal ventaja el tratarse de un protocolo desarrollado y estandarizado por G.von Hagens y que ha sido ampliamente revisado por otros autores [5]; y como principal inconveniente, la necesidad de usar temperaturas de congelación (-15ºC/-25ºC). Se han descrito otras técnicas de silicona en frío [6], así como aquellas que permiten la impregnación a temperatura ambiente y que, por lo tanto, simplifican el equipamiento necesario [7]. Sin embargo, el protocolo para estas últimas no está estandarizado como en la técnica S10 por lo que los resultados son menos estables.
Tomando como referencia la técnica S10, se presentan a continuación los aspectos más significativos para cada una de las fases de dicha técnica.
Fijación y preparación de la pieza:
Cualquier material biológico es susceptible de ser conservado mediante las técnicas de silicona. En general, es necesario una primera fase de fijación con técnicas clásicas y, aunque cualquier método de fijación es válido, la mejor opción para lograr resultados estables y evitar problemas durante el proceso de plastinación es usar formaldehído a diferentes concentraciones [8,9] El uso de mezclas embalsamadoras que contienen productos como glicerina, fenol u otros, implica la necesidad de retirar previamente estos componentes de los tejidos mediante lavados en etanol y agua corriente para evitar interferencias en el correcto desarrollo del protocolo de plastinación.
En el caso de órganos huecos, la fijación por dilatación permite la correcta conservación del lumen e incluso su exploración con técnicas endoscópicas una vez finalizada la plastinación. La inyección vascular, tanto arterial como venosa, con silicona, látex o sustancias radioopacas es compatible con la plastinación, la única precaución necesaria es emplear pigmentos resistentes a solventes pues las piezas permanecen varias semanas en acetona durante la deshidratación [10]. De igual forma es posible plastinar secciones encefálicas de cierto grosor sometidas a tinciones específicas para diferenciar la sustancia gris [11].
Deshidratación por sustitución en frío:
Se basa en el empleo de solventes como la acetona, aunque también pueden ser empleados otros solventes solubles en agua como alcoholes. Durante esta fase ocurre el mayor porcentaje de retracción, sobre todo en determinados tejidos como el nervioso. Sin embargo, el uso de acetona a -25ºC y la monitorización periódica del grado de deshidratación de las piezas permite reducir el grado de retracción de las mismas. En órganos o prosecciones con abundante tejido graso, excepto encéfalo, es necesario retirar parcialmente la grasa superficial, manteniendo la pieza a temperatura ambiente en acetona o en soluciones con mayor poder desengrasante como el diclorometano. Esto permite que tras la plastinación la grasa no se oxide y sea estable en el tiempo.
Impregnación forzada por vacío:
Las características fisicoquímicas de la acetona permiten que, además de actuar como desecante durante la deshidratación, pueda ser reemplazada por silicona en condiciones de vacío durante la impregnación. Esta fase es la más crítica, en ella se sustituye de manera controlada la acetona presente en los tejidos de las piezas deshidratadas por una solución de impregnación compuesta por silicona S10 más un catalizador o elongador de cadenas denominado S3. Esta sustitución se realiza en frío (-15/-20ºC) y en condiciones de vacío, por ello, también se conoce como impregnación forzada por vacío. La velocidad de impregnación se controla mediante el ajuste de la presión existente en la cámara de impregnación, lo que se monitoriza mediante manómetros. El ritmo de impregnación se refleja en la velocidad con la que aparecen burbujas de vapor de acetona en la superficie de la solución de impregnación. Una excesiva velocidad de impregnación supone un desequilibrio entre el volumen de acetona extraído de la pieza y el volumen de solución de impregnación que accede a los tejidos de la pieza, y en consecuencia, un mayor grado de retracción. En general, la fase de impregnación se considera finalizada al alcanzar presiones inferiores a 5 mmHg, lo que ocurre tras varias semanas. Piezas pequeñas y órganos huecos pueden impregnarse en una semana, mientras que órganos macizos o piezas grandes como cadáveres completos pueden necesitar varios meses.
Polimerización o curado:
Esta última fase persigue solidificar la silicona que hay en los tejidos de la pieza impregnada. Al inicio de la polimerización es posible recuperar la forma de los órganos huecos, mejorar la disección de las piezas, abrir nuevas ventanas en cavidades, posicionar vasos y nervios, etc. Además, el curado puede variar dependiendo del tipo de espécimen. Así, en órganos macizos como encéfalo, hígado, musculatura, etc, interesa un curado rápido que evite la excesiva perdida silicona, y por tanto, de volumen del órgano, para lo que se emplea el endurecedor S6 en forma de gas. Se trata de un crosslinker que establece puentes cruzados entre las moléculas de silicona y permite forzar la polimerización de superficie en solo unos días. Sin embargo, si se trata de órganos huecos como pulmones, tractos gastrointestinales etc, donde se busca cierta flexibilidad, se opta por un curado lento en el que actúa el catalizador S3 que se ha incorporado en los tejidos junto a la silicona S10 durante la impregnación. Este elongador de cadenas es muy activo a temperatura ambiente y permite lograr elasticidad en órganos huecos, aunque para ello es necesario esperar varios meses. Tras la polimerización o curado de la superficie del órgano, la técnica se puede considerar finalizada, aunque el curado definitivo en el interior de la pieza no ocurre hasta varios meses después.

Aplicaciones de la técnica S10:
Docencia: La principal aplicación de los órganos procesados con la técnica S10 o cualquier otra técnica de plastinación con silicona es la docencia [3,12,13]. Gran número de universidades emplean estos recursos en su docencia de anatomía en Medicina[14], Fisioterapia, Odontología [15], Veterinaria[13]. En ocasiones, aunque en menor medida, se ha extendido su empleo en la docencia de Anatomía Patológica [16,17], Parasitología, etc. De igual forma, existen referencias de la aplicación en docencia de postgrado y cursos de especialización, concretamente en el entrenamiento de técnicas quirúrgicas de mínima invasión donde es posible obtener órganos como pulmones y tractos gastrointestinales preparados para su exploración endoscópica [18-20]. Secciones corporales seriadas plastinadas o disecciones tridimensionales en neuroanatomía son empleadas como base para la interpretación de técnicas de diagnostico por imagen [11,21-23]. Cadáveres completos plastinados inyectados con sustancias radiopacas son de gran ayuda como herramienta para facilitar el aprendizaje de la anatomía vascular en el entrenamiento de técnicas de radiología intervencionista endovascular. Los beneficios de la plastinación como herramienta complementaria en el proceso enseñanza-aprendizaje de la anatomía y de otras materias son indudables, y en este sentido, se han tratado de cuantificar en estudios de opinión y resultados con grupos de estudiantes de diferentes materias y universidades [13,24,25].
Investigación: Además de la aplicación docente, se han publicado numerosos trabajos de investigación, principalmente clínica, empleado como base los órganos conservados con estas técnicas de plastinación. Se han diseñado nuevos abordajes quirúrgicos en territorios anatómicos complejos, se han descrito variaciones anatómicas desconocidas, etc [26].
En los últimos años una de las aplicaciones que mayor desarrollo ha tenido ha sido la conservación del patrimonio arqueológico. Existen laboratorios de plastinación vinculados a esta actividad trabajando principalmente con material subacuático. En este sentido, se ha descrito el empleo de estas técnicas para la conservación de restos de madera, cuero, hueso, etc. Actualmente, estamos desarrollando un proyecto en colaboración con el Museo Nacional de Arqueología Subacuática para emplear la técnica de plastinación S15 en la conservación de defensas de elefante de la época fenicia (S. VII a.C.) [27].

II.- Técnicas de poliéster
Estas técnicas de plastinación se diseñaron para la conservación de secciones encefálicas con un grosor entre 3 y 5mm, pues se trata de técnicas que potencian la diferenciación entre las sustancias gris y blanca. Las técnicas más conocidas son la P40 y la P35 (Biodur ®) [28,29], la primera es técnicamente más sencilla, y por ello, la más conocida y empleada. Del protocolo P40 [28] se pueden destacar algunos aspectos importantes.
Preparación de los encéfalos y obtención de cortes:
El protocolo de estas técnicas comienza con la fijación del encéfalo, a ser posible, en formaldehido con porcentajes progresivamente crecientes. Tal y como se ha comentado anteriormente, el uso de mezclas embalsamadoras limita en gran medida la calidad final de los cortes plastinados. En concreto, se ha descrito en numerosos trabajos que la presencia de restos de fenol o gliceria en los cortes provoca la aparición de manchas naranjas y la deformación de los cortes a las pocas semanas de finalizar su plastinación [22,29]. Si se precisa inyección vascular es aconsejable emplear silicona pigmentada en lugar de látex o resina epoxy. Los cortes se obtienen en sierra de disco con el bloque encefálico fijado y a temperatura ambiente. En ocasiones se puede utilizar gelatina para conservar la posición y orientación de cada una de las porciones que integran un mismo corte.
Deshidratación por sustitución en frío:
El protocolo para la deshidratación es básicamente similar al descrito en la técnica S10, con la diferencia de que en este tipo de cortes la deshidratación se completa en menos de una semana. Tal y como se ha comentado anteriormente, nunca se emplea acetona a temperatura ambiente, lo que permite minimizar la retracción.
Impregnación forzada por vacío:
Los cortes de encéfalo saturados en acetona son impregnados con poliéster P40 a temperatura ambiente y en condiciones de vacío. Durante la impregnación es importante mantener oscuridad pues el poliéster es sensible a la luz ultravioleta. El ajuste progresivo y monitorización de la presión en los manómetros permite finalizar la impregnación en 48h, una vez que se alcanza la presión de 10mmHg y cesa la evaporación de acetona.
Polimerización:
La luz ultravioleta es el agente empleado para la polimerización. Los cortes impregnados se introducen en cámaras planas de cristal rodeados de P40. Tras cerrar dichas cámaras éstas se exponen a luz ultravioleta en unas condiciones de tiempo y distancia definidas, que permiten su polimerización en 4-6 horas. Tras retirar las cámaras de cristal los cortes polimerizados quedan rodeados por una capa de poliéster transparente del mismo grosor, lo que permite una fácil manipulación de los mismos.
Aplicaciones técnica P40:
La mayoría de los artículos publicados en relación a esta técnica destacan la docencia en neuroanatomía como principal aplicación de este tipo de cortes plastinados [3,22]. Sin embargo, en los últimos años se han publicado varios trabajos sobre la posibilidad de emplear esta técnica para conservar secciones corporales manteniendo transparencia a lo largo del tiempo y sin virar a tonos naranjas, como ocurre con los cortes conservados con las técnicas de epoxy [30,31]. A pesar de ello, el empleo del P40 en investigación con secciones corporales transparentes tiene como principal limitación su elevado porcentaje de retracción durante la polimerización.

III.- Técnicas de epoxy
Las técnicas de plastinación con epoxy están diseñadas para conservar secciones corporales transparentes. Aunque se han descrito varias técnicas, la más conocida y extendida es la E12 (Biodur ®)[2]. Conviene destacar algunos aspectos técnicos respecto al protocolo de la técnica E12 [32]
Preparación de los especímenes y obtención de cortes:
Habitualmente se trabaja con piezas fijadas, sin embargo existe la opción de trabajar con material fresco. En el caso de realizar inyección vascular es aconsejable emplear resina epoxy coloreada con pigmento resistente a solventes en vez de látex o silicona. Para la obtención de los cortes la pieza anatómica se debe congelar a la temperatura más baja posible, normalmente -70/-80ºC. Los cortes se realizan en sierra de banda y es aconsejable emplear nieve carbónica o nitrógeno líquido para mantener frío en el tope de la sierra sobre el que se desplaza la pieza en cada corte. De esta forma, se obtienen secciones de 1.5-3mm de grosor. La manipulación durante la limpieza de los cortes es siempre en congelación para lo que se emplea acetona a -40ºC.
Deshidratación por sustitución en frío y desengrasado:
La deshidratación es similar a la descrita en la técnica P40. La principal diferencia consiste en la necesidad de retirar el tejido graso para obtener el máximo grado de transparencia, sobre todo en las zonas de tejido conectivo. Ello se logra con varios baños en acetona o en diclorometano a temperatura ambiente.
Impregnación forzada por vacío:
La solución de impregnación empleada consiste en epoxy E12 junto con endurecedor E1. Los cortes deshidratados se sumergen en dicha mezcla y la impregnación forzada por vacío se realiza en 6-12 h a temperatura ambiente.
Polimerización:
La polimerización, en cámaras planas de cristal, se ha de hacer inmediatamente tras terminar la impregnación, lo que evita que los cortes polimericen en la cámara de impregnación. El protocolo para realizar las cámaras de cristal es similar al empleado en la técnica P40. Sin embargo, en este caso el agente que desencadena la polimerización, junto al endurecedor E1, es la temperatura. Los cortes se han de colocar en estufa a 40ºC durante 4-6 días. Existen métodos alternativos a las cámaras planas de cristal como es el método sandwich [32] que ahorra tiempo y es más sencillo.

Aplicaciones técnica E12:
Aunque esta técnica se ha posicionado como la mejor opción para el aprendizaje de la anatomía seccional como base para el diagnóstico por imagen [14], la principal aplicación es en la investigación anatómica. El bajo índice de refracción de la resina epoxy E12 junto a su mínima retracción durante la polimerización la convierte en la técnica de elección para estudiar diferentes tejidos, en diferentes planos del corte, desde un nivel macroscópico hasta microscópico. La ausencia de manipulación y descalcificación hace que la topografía de las estructuras anatómicas no se vea afectada.
La eliminación del tejido graso permite que el tejido conectivo, vasos sanguíneos y nervios se identifiquen con toda claridad sin sufrir manipulación.
Empleando esta técnica se han identificado estructuras anatómicas o relaciones topográficas no descritas previamente como: la membrana atlanto-occipital posterior y su unión a la duramadre espinal en vez de al atlas, lo que puede traducirse una potencial etiología de dolores de cabeza de origen cervical[33]; la pared medial del seno cavernoso [34]; el ligamento de la nuca y su relación con los ligamentos supraespinosos del cuello [35,36]; la relación de la raíz del nervio trigémino con las estructuras vecinas como base de la neuralgia trigeminal [37], etc. De igual forma, estas técnicas han permitido corregir descripciones anatómicas erróneas como al demostrar la ausencia del ligamento de la nuca en el espacio de la región atlanto-occipital posterior o desmentir que la fascia cervical sea una barrera en el bloqueo del plexo cervical en la región anterior del cuello [38].
En el área del diagnóstico por imagen esta técnica ha sido ampliamente usada para la interpretación macro y microscópica de estructuras anatómicas en cortes obtenidos en los mismos planos que las técnicas de imagen, como por ejemplo en la articulaciones temporomandibular [39-42], tarso[43] o codo [44,45], al igual que para la identificación de paquetes neuromusculares en la planificación de abordajes artroscópicos en el tarso [46,47]o en el carpo[48], o para la evaluación patologías clínicas en modelos animales [49].
Con el objetivo de lograr secciones plastinadas de un grosor inferior a 1mm se ha desarrollado la técnica E12 utra-thin[50] [51], que permite la obtención de secciones de 400-500μm en sierra de diamante, sin necesidad de descalcificación. Incluso se pueden obtener cortes que incorporen implantes metálicos o cerámicos para estudiar la interfase de estos biomateriales. Estos cortes, de un tamaño de hasta 10X10 cm, se pueden llevar por debajo de 100μm de grosor tras un desbastado adecuado, lo que permite aplicar tinciones histológicas que permiten una transición del estudio macro al micro en la misma preparación. De esta forma, se han abordado estudios microscópicos de laringes completas [52], o más específicos, mediante microCT y RM de la articulación cricotiroidea y su relación con la capsula fibrosa articular [53]. Muchos de estos trabajos, además de utilizar tinciones histológicas de las secciones obtenidas, emplean como base del estudio histológico el microscopio confocal y la autofluorescencia del propio tejido plastinado [54].
Determinadas regiones anatómicas presentan una morfología complicada para ser estudiada en secciones en 2D. En este sentido, secciones plastinadas transparentes obtenidas con la técnica E12 ultra-thin son ampliamente empleadas para obtener reconstrucciones 3D no solo de estructuras óseas sino también de otros tejidos en regiones como la base del cráneo [55], el tarso [56], la cadera [57] etc. La precisión de estas reconstrucciones es superior a la obtenida en las imágenes de TC o RM, y se caracterizan por: 1) permitir que todas las estructuras puedan ser representadas de forma individual o conjunta y rotadas en cualquier plano, 2) permitir la medida de diámetros y ángulos de cualquier estructura, y 3) permitir que los datos de morfometría sean directamente extrapolados a posibles conclusiones clínicas y quirúrgicas. De esta forma se ha descrito, por ejemplo, que el músculo levator ani no rodea la parte ventral de la uretra y que carece de acción en la continencia en ambos sexos [58], lo que determina el diseño de las técnicas quirúrgicas de reconstrucción del esfínter uretral. Por otro lado, las técnicas quirúrgicas para incontinencia femenina se basan en la fijación de la uretra al pubis u otras estructuras próximas, sin embargo estudios anatómicos basados en secciones seriadas plastinadas demuestran que la uretra femenina no tiene fijación directa al pubis y permanece libre en su recorrido pélvico [59]. En este sentido, diferentes estudios comparando el tejido conectivo en pelvis de fetos y adultos mediante secciones anatómicas plastinadas concluyen en la necesidad de revisar las técnicas quirúrgicas de esta región de forma multidisciplinar [60].
La aplicación museística de especimenes plastinados con cualquiera de las técnicas nombradas anteriormente es, sin lugar a duda, la aplicación más polémica por la repercusión social, especialmente cuando se trata de tejido biológico humano. Se han publicado numerosas editoriales en revistas científicas de Anatomía opinando sobre el aspecto ético de exhibir cuerpos humanos plastinados al público general [61-64].
Quizás, como principal idea y para finalizar esta revisión cabría resaltar la cita de Gareth Jones & Whitaker (2009) “There is an urgent need for anatomists to utilize what is being presented to the general public in these exhibitions and build upon this in their own teaching and research” [63]

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